I molekylärbiologi kan bra buffertval och förberedelse för olika DNA-isoleringssteg vara skillnaden mellan att gå vidare till proteinuttryck eller öppna ett annat maxi-prep-kit för att börja om. Trots deras avgörande betydelse är buffertrecept ofta bara det-recepten skrivna utan förklaring eller rationale för de olika komponenterna. En sådan buffert är glukos-tris-EDTA eller GTE-buffert.
$config[code] not foundVad används GTE för?
GTE används för att resuspendera bakteriecellpellets före lysning (brytning) av cellerna och skörd av plasmid-DNA-inuti. Lysozym, som mjukgör cellmembranen, tillsättes ofta tillsammans med GTE-bufferten. Uppnå en homogen suspension av hela celler under detta steg så att den efterföljande tillsatta lyslösningen kan komma till alla celler är nyckeln till att få bra DNA-utbyten. GTE är utformad för att göra detta samtidigt som det ger en stabil miljö för DNA.
Glukos för osmolaritet
50 mM (millimolärt) glukosocker tillsätts till GTE-buffert för att upprätthålla osmolaritet där lösningsmedelskoncentrationen utanför cellerna ligger nära det i cellerna. Detta förhindrar för tidig celllys, vilket kan orsaka lägre DNA-utbyte till följd av aggregering och nedbrytning. De andra komponenterna i bufferten bidrar också till lösningen osmolaritet, men glukos, som är en icke-elektrolyt, är ett bra val eftersom det inte stör lösningens buffertegenskaper.
Tris för pH-stabilitet
Tris är det korta namnet för tris (hydroximetyl) aminometan, vilket är en mycket vanlig pH-buffert. I fallet med GTE-buffert tillsätts syresaltet (Tris-HCl) till bufferten i en koncentration av 25 mM. Detta upprätthåller lösningens pH vid ett nära fysiologiskt 8,0, ett idealiskt pH för att förhindra sur hydrolys (nedbrytning) av plasmid-DNA och oönskade sidoreaktioner hos de andra cellkomponenterna.
EDTA förhindrar DNA-nedbrytning
EDTA eller etylendiamintetraättiksyra, fångar eller "chelaterar" metalljoner ut ur lösningen, vilket hindrar dem från att delta i oönskade sidoreaktioner. I GTE-buffert tillsätts EDTA vid 10 mM. Dess främsta syfte är att i bufferten runda upp fri zink, magnesium och kalcium, vilket förhindrar DNA-nedbrytning genom vissa vägar som kräver dessa metaller.
Några viktiga tips
Håll din GTE-buffert kall och gör den i små mängder för att förhindra tillväxt av oavsiktliga bakterier i den. Socker och det kontrollerade pH-värdet ger ett bra tillväxtmedium. Använd alltid renat vatten. Kranvatten kan ha ett överskott av metalljoner från rören, vilket kan överväldiga EDTA: s förmåga att fånga. Om du misstänker närvaron av interfererande RNA i ditt prov, lägg till RNase A vid 100 mikrogram per milliliter till din GTE-buffert för att eliminera problemet.
